ΑΝΤΩΝΙΟΣ ΓΕΩΡΓΑΣ1*, ΕΥΑΓΓΕΛΟΣ ΛΑΜΠΑΣ2, ΔΗΜΗΤΡΑ ΧΟΥΧΟΥΛΑ3, ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΣΚΟΥΦΙΑΣ1, ΣΩΤΗΡΙΟΣ ΠΑΤΣΙΛΙΝΑΚΟΣ2, ΙΟΡΔΑΝΗΣ ΤΣΑΦΑΡΙΔΗΣ4, ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΠΑΤΡΙΝΟΣ5, ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΑΔΑΜΟΠΟΥΛΟΣ6, ANGELO FERRARO1, ΕΥΑΓΓΕΛΟΣ ΧΡΙΤΟΦΟΡΟΥ1
1 Εργαστήριο Ηλεκτρονικών Αισθητηρίων, Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο
2 Κωνσταντοπούλειο Γενικό Νοσοκομείο Νέας Ιωνίας
3 Πανεπιστήμιο Δυτικής Αττικής
4 Katharsis Technologies Inc., Βανκούβερ, Καναδάς
5 Πανεπιστήμιο Πατρών
6 Galenica SA, Κηφισιά
ACE2-based capacitance sensor for rapid native SARS-CoV-2 detection in biological fluids and its correlation with real-time PCR
Δημοσιεύτηκε στο περιοδικό: Biosensors and Bioelectronics 21 January 2022 https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114021
Η εξάπλωση του SARS-CoV-2 και η αυξανόμενη απειλή του για την ανθρώπινη υγεία σε όλο τον κόσμο έχει καταστήσει επιτακτική την ανάγκη ανάπτυξης νέων τεχνολογικών εργαλείων για την καταπολέμηση του ιού. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στην ανάπτυξη διαγνωστικών μεθόδων που καταγράφουν την εξάπλωση του ιού γρήγορα και αποτελεσματικά. Σε αυτή την μελέτη αναπτύξαμε έναν βιοαισθητήρα για την ταχεία ανίχνευση του κορονοϊού, που βασίζεται στην ακινητοποίηση της πρωτεΐνης-υποδοχέα ACE2 στην επιφάνεια χρυσών ενδοδιαπλεκόμενων ηλεκτρωδίων. Το ACE2 είναι ο βασικός υποδοχέας για τους ιούς SARS-CoV. Η σύνδεση αυτών των ιών γίνεται με την βοήθεια της γλυκοπρωτεΐνης S την οποία διαθέτουν στο εξωτερικό τους περίβλημα.
Αρχικά, η πρωτεΐνη-υποδοχέας ακινητοποιείται στην επιφάνεια των ενδοδιαπλεκόμενων ηλεκτροδίων. Στην συνέχεια τοποθετείται βιολογικό δείγμα (ρινοφαρυγγικό ή σάλιο) πάνω στο στρώμα του ACE2. Αν σε αυτό το δείγμα υπάρχουν σωματίδια του ιού, ή και μόνο η πρωτεΐνη S, τα σωματίδια δεσμεύονται από το ACE2 επιφέροντας μια αλλαγή στις διηλεκτρικές ιδιότητες του υλικού ή στο πάχος του διηλεκτρικού στρώματος. Αυτή η αλλαγή καταγράφεται ως αλλαγή στην αντίσταση και την χωρητικότητα μεταξύ των ηλεκτροδίων του πυκνωτή. Η παρακολούθηση της αλλαγής της χωρητικότητας πραγματοποιείται με τον εξής τρόπο: 2 χρυσές βελόνες τοποθετούνται στα άκρα του πυκνωτή, όπου και εφαρμόζεται μια διαφορά δυναμικού. Οι βελόνες είναι συνδεδεμένες με ένα επιτραπέζιο μηχάνημα LCR (Hewlett Packard, μοντέλο 4284A Precision) το οποίο μετράει σε πραγματικό χρόνο την χωρητικότητα και την αντίσταση.
Τα δείγματα αποκτήθηκαν στο Κωνσταντοπούλειο Γενικό Νοσοκομείο Νέας Ιωνίας. Κατά την απόκτηση των δειγμάτων ακολουθήθηκαν όλα τα προβλεπόμενα πρωτόκολλα αφαλείας, ενώ διατηρήθηκε η ανωνυμία των δωτών για προστασία των προσωπικών τους δεδομένων.
Παράλληλα με την διαδικασία μέτρησης των δειγμάτων με τον βιοαισθητήρα, τα δείγματα μετρήθηκαν και με την μέθοδο της real-time PCR, ώστε να υπάρξει εκ των υστέρων η συσχέτιση των αποτελεσμάτων. Για την εξαγωγή του RNA χρησιμοποιήθηκε το GXT NA Extraction Kit DNA/RNA 200 virus. Στην συνέχεια το RNA μετατράπηκε σε cDNA και πολλαπλασιάστηκε με χρήση του YouSeq® SARS-CoV-2 COVID-19 RT-qPCR kit (YouSeq, Winchester, England).
Το διάστημα μέτρησης με τον βιοαισθητήρα είναι 1 λεπτό. Σε αυτό το διάστημα παρατηρήθηκαν 3 ενδεχόμενα: Για δείγματα που δεν περιείχαν τον ιο η αλλαγή της χωρητικότητας ήταν μικρότερη του 1%. Για δείγματα που περιείχαν μικρό ιικό φορτίο (<103 virus copy numbers/μL) η αλλαγή στην χωρητικότητα ήταν μεταξύ 1 και 2%. Ενώ για δείγματα με ιικό φορτίο >103 virus copy numbers/μL η αλλαγή στην χωρητικότητα ήταν μεγαλύτερη του 2%.
Όταν ο αισθητήρας χρησιμοποιήθηκε σε εργαστηριακές συνθήκες για τον έλεγχο δειγμάτων που περιείχαν μόνο την πρωτεΐνη S, επιβεβαιώθηκε η δυνατότητα ανίχνεσυσης με όριο ανίχνευσης [LOD] τα 750 pg/μL/mm2. Στην εξέταση ρινοφαρυγγικών δειγμάτων επαληθεύτηκε ότι ο βιοαισθητήρας μπορεί να διακρίνει δείγματα θετικά στον ιό από αυτά που είναι αρνητικά, σε συνολικά 7 θετικά και 16 αρνητικά δείγματα. Ακόμα, δοκιμάστηκε η απόκριση του αισθητήρα σε δείγμα σάλιου, καθώς όταν από τον ίδιο ασθενή αποκτήθηκε και ρινοφαρυγγικό δείγμα και δείγμα σάλιου, παρατηρήθηκε ότι και τα 2 δείγματα μεταβάλλουν την χωρητικότητα, απλά η μεταβολή που επιφέρει το δείγμα σάλιου είναι μικρότερη, πράγμα λογικό αφού στο σάλιο είναι μικρότερο το ιικό φορτίο. Επιπλέον, ο βιοαισθητήρας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ημιποσοτική μέτρηση, αφού οι μετρήσεις του χωρίζονται σε 3 περιοχές, τα αρνητική δείγματα, τα ελαφρώς θετικά και τα θετικά δείγματα. Η αναπαραγωγιμότητα των πειραμάτων αποδείχθηκε με τουλάχιστον 3 επαναλήψεις ανά δείγμα, ενώ για την δοκιμή της σταθερότητας κάποιοι από τους αισθητήρες διατηρήθηκαν πριν την χρήση τους στο ψυγείο στους 4 ◦C για 7 ημέρες.
Συνεπώς, σε αυτή την εργασία αναπτύχθηκε ένας βιοαισθητήρας που μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως rapid screening test για την ανίχνευση του SARS-CoV-2 σε λιγότερο από 2 λεπτά. Στην μελλοντική μας εργασία, κομμάτι της οποίας παρουσιάστηκε στο 2ο Διεθνές Ηλεκτρονικό Συνέδριο Βιοαισθητήρων (IECB 2022) στο άρθρο μας με τίτλο “A portable screening device for SARS-CoV-2 with smartphone readout” επιχειρούμε να εξελίξουμε τον βιοαισθητήρα σε μια πλήρως λειτουργική-φορητή συσκευή για την ταχεία ανίχνευση του ιού.